Microbe yang terhormat

Share Tweet Pin it

Sejak Pasteur, diketahui bahwa saluran pencernaan manusia pada dasarnya adalah bioreaktor tipe aliran, di mana banyak mikroorganisme hidup. Sikap para ilmuwan terhadap mikroflora usus selama ini telah berubah secara radikal. Seratus tahun yang lalu, Ilya Mechnikov yang hebat, pendiri teori modern imunitas, untuk penciptaan yang ia terima Hadiah Nobel (untuk dua dengan lawan bebuyutannya, Paul Ehrlich yang tidak kalah hebat), bahkan menawarkan untuk menghapus usus besar sebagai salah satu cara untuk memperpanjang hidup. Dan bagi mereka yang ukuran ini tampak terlalu radikal, saya merekomendasikan untuk minum sebanyak mungkin kefir untuk menekan berbahaya, menurut pendapatnya, mikroba dengan bakteri asam laktat yang bermanfaat. Setelah setengah abad, kursus telah berubah 180 derajat. Ternyata mikroflora usus normal, serta kulit dan selaput lendir, melakukan banyak fungsi yang berguna - misalnya, itu menekan aktivitas vital mikroorganisme patogen yang terus-menerus menyerang tubuh. Dan dalam beberapa tahun terakhir, para ahli mikrobiologi yang paling berani telah melangkah lebih jauh, menyatakan manusia dan mikroba-nya sebagai superorganisme simbiotik tunggal.

Pengembangan metode biologi molekuler membawa para ilmuwan ke tingkat baru untuk memahami proses simbiosis manusia dan mikroflora, yang tampaknya dipelajari dengan baik dan dari studi yang tidak mengharapkan kejutan khusus. Pertumbuhan cepat dalam kecepatan dan jatuhnya biaya metode pengurutan DNA (menentukan urutan nukleotida) dan peningkatan paralel dalam kekuatan komputer pribadi dan perkembangan Internet memungkinkan untuk menganalisis informasi pada wilayah besar genom. Setelah kromosom dari ratusan spesies bakteri individu telah diuraikan, pendekatan baru telah muncul dalam genetika mikroorganisme - pendekatan populasi: menganalisis gen dari semua bakteri yang menghuni area tertentu sekaligus. Tentu saja, populasi "bioreaktor manusia" ternyata menjadi salah satu yang paling penting untuk studi populasi mikroba.

Pekerjaan pertama, yang mengarah pada tampilan baru pada mikrobiota usus, diterbitkan pada tahun 1999 oleh sekelompok ilmuwan dari Institut Nasional Penelitian Agronomi (Prancis) dan Universitas Reading (Inggris). Para penulis memutuskan untuk menerapkan metode pengurutan gen 16S RNA untuk mempelajari populasi mikroba usus.

16S RNA - ID Bakteri

Sejak Pasteur, langkah pertama dan yang diperlukan dalam penentuan mikroorganisme adalah kultivasi mereka pada media nutrisi. Tetapi banyak mikroba penting (dan menguntungkan, dan patogen) tidak mau tumbuh dalam medium apa pun. Adalah mungkin untuk mempelajari bakteri tidak berbudaya yang tidak dapat diakses sebelumnya dan mulai menetapkan ketertiban dalam sistematika yang sangat rumit dari prokariota yang sudah dikenal dengan perkembangan bioinformatika dan munculnya metode modern biologi molekuler - polymerase chain reaction (PCR), yang memungkinkan jutaan dan miliaran salinan yang tepat untuk diperoleh dari segmen DNA tunggal, kloning yang dipilih menggunakan gen PCR dalam plasmid bakteri dan teknik sekuensing untuk urutan nukleotida yang diperoleh sebagai hasil dari semua ini cukup untuk ana Iza jumlah.

Sebuah penanda ideal untuk mengidentifikasi mikroorganisme adalah gen yang mengkode RNA ribosom 16S (masing-masing dari dua subunit dari lokakarya sel ribosom untuk sintesis protein - terdiri dari molekul protein yang terjalin dan rantai asam ribonukleat).

Gen ini ada dalam genom semua bakteri dan archaea yang diketahui, tetapi tidak ada pada eukariot dan virus, dan jika Anda telah menemukan urutan nukleotida karakteristiknya, Anda pasti berurusan dengan gen prokariot. (Untuk menjadi sangat tepat, gen RNA 16S juga ada dalam eukariota, tetapi tidak dalam kromosom nuklir, tetapi pada kromosom mitokondria. Ini sekali lagi menegaskan bahwa mitokondria adalah keturunan jauh dari bakteri simbion dari organisme eukariotik pertama.)

Gen ini memiliki kedua wilayah konservatif, sama untuk semua prokariota, dan spesifik-spesies. Situs konservatif berfungsi untuk tahap pertama dari reaksi rantai polimerase - melampirkan tes DNA ke primer (situs benih DNA yang dipelajari oleh rantai nukleotida yang diteliti untuk mulai menganalisis sisa rangkaian), dan spesifik-spesies - untuk menentukan spesies. Selain itu, tingkat kemiripan plot-plot spesifik spesies dengan sangat baik mencerminkan kekerabatan evolusioner dari spesies-spesies yang berbeda.

Bonus tambahan adalah bahwa untuk kloning dan analisis selanjutnya, Anda dapat menggunakan RNA ribosom itu sendiri, yang ada di sel mana pun dalam jumlah yang jauh lebih besar daripada gen yang sesuai. Hanya Anda harus terlebih dahulu "menulis ulang" itu dalam DNA menggunakan enzim khusus - reverse transcriptase.

Urutan nukleotida 16S RNA dari semua bakteri dan archaea yang diketahui (sekitar 10.000 spesies) tersedia secara luas. Urutan diidentifikasi dibandingkan dengan mereka dalam database dan secara akurat mengidentifikasi jenis bakteri atau menyatakan itu milik spesies yang tidak digali berikutnya.

Baru-baru ini telah ada revisi intensif dari klasifikasi lama, fenotipik, bakteri, berdasarkan kriteria yang diformalkan dengan buruk - dari penampilan koloni ke preferensi makanan dan kemampuan untuk diwarnai dengan berbagai zat warna. Sistematika baru didasarkan pada kriteria molekuler (16S RNA) dan hanya sebagian mengulangi fenotipik.

Urutan pengkodean 16S RNA menggunakan PCR diekstraksi langsung dari "lingkungan" - 125 miligram manusia, maafkan saya, tinja, dimasukkan ke dalam plasmid Escherichia coli (bukan karena usus, tetapi karena Escherichia coli adalah salah satu workhorses favorit ahli biologi molekuler ) dan lagi diisolasi dari kultur bakteri yang diperbanyak. Dengan demikian, perpustakaan gen RNA 16S dari semua mikroorganisme dalam sampel dibuat. Setelah itu, 284 klon dipilih secara acak dan diurutkan. Ternyata hanya 24% dari sekuens 16S RNA yang diperoleh milik mikroorganisme yang diketahui sebelumnya. Selama lebih dari seratus tahun, tiga perempat dari mikroflora di usus setiap orang telah menghindari perhatian para peneliti yang dipersenjatai dengan metode-metode mikrobiologi klasik! Para ilmuwan hanya tidak dapat menemukan kondisi untuk budidaya bakteri ini, karena penduduk yang paling berubah-ubah dari usus menolak untuk tumbuh pada media mikrobiologi tradisional.

Hari ini, menggunakan metode molekuler, telah ditetapkan bahwa 10 dari 70 taksa bakteri besar terwakili dalam mikrobiota orang dewasa. Sekitar 90% mikroba kita termasuk ke dalam jenis Firmicutes (misalnya, lactobacteria yang terkenal adalah penyebab utama dari susu souring) dan Bacteroidetes adalah obligat anaerob (organisme yang dapat hidup hanya tanpa adanya oksigen), yang sering digunakan sebagai indikator pencemaran. pembuangan air alami. Sisa 10% dari populasi dibagi antara Proteobacteria taxa (mereka termasuk, antara lain, E. coli), Actinobacteria (salah satu jenis actinomycetes diisolasi antibiotik streptomisin), Fusobacteria (penghuni biasa rongga mulut dan penyebab umum penyakit periodontal), Verrucomicrobia (baru-baru ini sumber panas bumi ditemukan menjadi spesies mikroba yang memakan metana, yang melimpah di usus karena aktivitas vital mikroorganisme lainnya, Cyanobacteria (mereka masih sering disebut nama lama "ganggang biru-hijau"), Spirochaeates ( tew, not pale), Synergistes dan VadinBE97 (hewan macam apa ini, tanyakan kepada pencipta sistematika prokariot yang baru).

Terlepas dari kenyataan bahwa komposisi spesies mikroorganisme usus agak monoton, rasio kuantitatif perwakilan kelompok sistematik tertentu dalam mikrobiota orang yang berbeda dapat sangat bervariasi. Tapi apa itu mikroflora usus normal dan bagaimana cara pembentukannya?

Pertanyaan ini dijawab dalam sebuah karya 2007 oleh sekelompok ahli biologi Amerika yang dipimpin oleh Patrick Brown dari Universitas Stanford. Mereka menelusuri pembentukan mikrobiota pada 14 bayi yang baru lahir selama tahun pertama kehidupan. Para penulis mampu menetapkan beberapa sumber kolonisasi saluran pencernaan. Mikrobiota bayi memiliki kemiripan dengan mikroflora ibu: sampel vagina, feses atau mikroflora ASI. Tergantung pada sumber kolonisasi, spesies yang berbeda berlaku di mikroflora usus bayi selama tahun pertama kehidupan. Perbedaan ini tetap signifikan selama seluruh periode penelitian, tetapi pada usia satu tahun, pembentukan mikrobiota dewasa menjadi nyata. Data menarik diperoleh pada contoh sepasang kembar. Mikroflora di dalamnya hampir identik dalam komposisi dan berubah dengan cara yang sama juga. Temuan ini mengungkapkan peran besar dari komponen manusia dari pasangan mikrobiota-host dalam pembentukan populasi mikroflora usus. Demi kemurnian eksperimen, tentu saja, perlu untuk memisahkan bayi-bayi saat masih di rumah sakit - sebuah kisah hebat untuk film India! Selama bertahun-tahun, mereka saling mengenal dengan analisis... Tetapi data dari karya lain menegaskan asumsi bahwa individu, termasuk keturunan, fitur biokimia manusia memiliki pengaruh besar pada komposisi mikrobiota.

Mikroba dalam diri kita lebih dari manusia

Selain mempelajari jenis mikroflora usus tertentu, dalam beberapa tahun terakhir, banyak peneliti telah mempelajari metanol bakteri - satu set gen semua mikroorganisme dalam sampel isi usus manusia (baik dicuci keluar dari kulit, atau dalam sampel lumpur dari dasar laut). Untuk melakukan ini, mereka menggunakan teknologi sekuensing DNA yang paling otomatis, terkomputerisasi dan berkinerja tinggi, yang memungkinkan untuk menganalisis sekuens nukleotida singkat, menyusun teka-teki bersama beberapa huruf yang cocok di ujung bagian ini, mengulang prosedur ini berkali-kali untuk setiap bagian genom dan mendapatkan penguraian gen dan kromosom individual dengan kecepatan hingga 14 juta nukleotida per jam - lipat lebih cepat daripada ini dilakukan hanya beberapa tahun yang lalu. Jadi ditemukan bahwa mikrobiota usus manusia memiliki sekitar 100 trilyun sel bakteri - sekitar 10 kali lebih banyak dari jumlah total sel dalam tubuh inang. Seperangkat gen yang membentuk metagenome bakteri kira-kira 100 kali lebih besar daripada kumpulan gen tubuh manusia. Jika kita berbicara tentang volume reaksi biokimia yang terjadi di dalam populasi mikroba, itu lagi berkali-kali lebih tinggi daripada di tubuh manusia. “Reaktor” bakteri mengimplementasikan rantai metabolik pada organisme inang yang tidak dapat menopang dirinya sendiri - misalnya, sintesis vitamin dan prekursor mereka, dekomposisi racun tertentu, dekomposisi selulosa menjadi polisakarida yang dapat dicerna (dalam ruminansia), dll.

Studi yang dilakukan di laboratorium Jeffrey Gordon (School of Medicine di University of Washington, St. Louis, Missouri) memungkinkan untuk mengaitkan keragaman spesies bakteri dari saluran pencernaan dengan diet dan fitur metabolik individu. Hasil percobaan itu diterbitkan dalam edisi Nature edisi Desember 2006. Percobaan satu tahun menyarankan membangun korelasi antara kelebihan berat badan pada manusia dan komposisi populasi mikroba ususnya. Selusin orang gemuk yang setuju untuk meletakkan perut mereka di atas altar ilmu pengetahuan, dibagi menjadi dua kelompok. Satu melanjutkan diet rendah lemak, yang lain diet rendah karbohidrat. Semua relawan kehilangan berat badan, dan pada saat yang sama mereka mengubah rasio dari dua kelompok utama mikroorganisme usus: jumlah sel Firmicutes menurun, dan jumlah Bacteroidetes, sebaliknya, tumbuh. Pada diet rendah lemak, perubahan seperti itu menjadi terlihat kemudian - setelah pasien kehilangan 6% dari berat badan mereka, dan pada diet rendah karbohidrat - setelah kehilangan kilogram pertama (2% dari berat badan awal mereka). Dalam hal ini, perubahan komposisi mikroflora menjadi semakin nyata, semakin sedikit bobot peserta dalam eksperimen.

Secara paralel, di laboratorium yang sama, percobaan dilakukan pada tikus laboratorium membawa mutasi pada gen untuk leptin, "hormon kenyang," protein yang disintesis dalam sel-sel jaringan adiposa dan berkontribusi pada pembentukan rasa kenyang. Tikus yang telah merusak kedua salinan gen ini (mutasi ini ditunjukkan oleh indeks Lepo), makan 70% lebih banyak daripada jenis liar, dengan semua konsekuensi berikutnya. Dan kandungan Firmicutes di usus mereka adalah satu setengah kali lebih tinggi daripada garis heterozigot, dengan hanya satu alel yang rusak (ob / +), dan homozigot untuk gen normal garis tipe liar (+ / +).

Pengaruh mikroflora pada metabolisme "pemiliknya", para peneliti memeriksa model lain - tikus gnotobioticheskimi.

Hewan-hewan seperti itu, yang sejak lahir hidup di kamar steril dan belum pernah bertemu satu mikroba dalam hidup mereka, tidak sering digunakan dalam penelitian biomedis. Sterilitas absolut dalam otot, kelinci, dan terutama kandang kambing - mahal dan merepotkan, dan setelah bertemu dengan mikroba atau virus pertama, makhluk yang malang itu akan mati atau menjadi tidak cocok untuk percobaan lebih lanjut. Apa yang terjadi dalam gnotobiotov dengan sistem kekebalan adalah cerita yang terpisah, dan mereka makan selama tiga dan pada saat yang sama - kulit dan tulang karena kurangnya komponen mikroba pencernaan.

Setelah transplantasi mikroflora dari donor obesitas (ob / ob), tikus gnatobiot dalam dua minggu menebal hampir satu setengah kali (47%). Mereka yang “diunggulkan” dengan mikroflora dari donor wild-type (+ / +) dengan berat badan normal, pulih hanya sebesar 27%.

Hasil studi lebih lanjut dari perubahan pada organisme tikus-mikroba simbiotik secara brilian mengkonfirmasi hipotesis bahwa mikrobiota individu obesitas berkontribusi terhadap pengolahan makanan yang lebih dalam. Perbandingan sampel DNA tinja dari tikus obesitas dan tikus normal menunjukkan bahwa mikrobioma obesitas jenuh dengan gen enzim yang memungkinkan degradasi polisakarida yang lebih efisien. Usus tikus gemuk mengandung sejumlah besar produk akhir fermentasi - senyawa asam asetat dan butirat, yang mengindikasikan pemrosesan komponen makanan yang lebih dalam. Kalorimetrik (dari kata “kalori”!) Analisis sampel tinja menegaskan hal ini: tinja tikus ob / ob mengandung lebih sedikit kalori daripada tikus jenis liar, yang tidak sepenuhnya menyerap energi dari makanan.

Selain informasi penting tentang komponen "mikroba" obesitas, penulis mampu menunjukkan kesamaan mendasar mikroflora pada orang gemuk dan tikus, yang membuka perspektif baru dalam mempelajari masalah kelebihan berat badan, dan mungkin memecahkan masalah ini dengan "transplantasi" mikroflora sehat atau pembentukannya pada pasien. kegemukan.

Fakta bahwa mikrobiota dapat mengontrol metabolisme tuan rumah tidak lagi diragukan. Penelitian Gordon tentang kelebihan berat badan telah memungkinkan jembatan untuk pengobatan penyakit metabolik, seperti kelelahan umum yang mempengaruhi anak-anak dari satu sampai empat tahun di negara-negara miskin dengan iklim tropis - marasmus (kata ini hanya memiliki hubungan linguistik dengan marasmus: marasmos Yunani secara harfiah berarti kelelahan, kepunahan) dan kwashiorkor (dalam bahasa salah satu suku Ghana, kwashiorkor - "bocah merah"). Munculnya penyakit dikaitkan dengan kurangnya protein dan vitamin selama masa transisi dari menyusui hingga makanan dewasa. Tetapi penyakit ini secara selektif mempengaruhi anak-anak yang saudara-saudaranya tidak mengalami masalah dengan transisi ke diet tradisional untuk daerah tersebut. Penelitian telah menunjukkan bahwa mikroflora usus pada anak-anak yang sakit sangat berbeda dari mikroflora orang tua mereka, serta dari mikroflora saudara dan saudari yang sehat. Pertama-tama, ada catatan ketidakhadiran hampir lengkap pada populasi usus Bacteroidetes dan dominasi spesies langka yang termasuk jenis-jenis Proteobacteria dan Fusobacteria. Setelah anak-anak yang sakit (hati-hati, agar tidak overdosis!) Diumpankan makanan berprotein secara intensif, mikrobiota mereka menjadi serupa dengan yang normal, seperti pada kerabat, dengan dominasi Bacteroidetes dan Firmicutes.

Studi terbaru tidak hanya secara mendasar mengubah pemahaman saat ini dari mikroflora usus manusia, tetapi juga berkontribusi pada munculnya konsep yang menganggap mikrobiota usus sebagai "organ" multiseluler tambahan dari tubuh manusia. Organ yang terdiri dari berbagai jalur sel yang mampu berkomunikasi baik di antara mereka sendiri maupun dengan organisme inang. Tubuh yang mendistribusikan aliran energi, melakukan reaksi fisiologis yang penting, perubahan di bawah pengaruh lingkungan dan meregenerasi diri ketika perubahan disebabkan oleh kondisi eksternal.

Melanjutkan studi tentang "organ bakteri" dapat dan harus mengarah pada pemahaman tentang hukum fungsinya, pengungkapan koneksi halus dengan organisme inang dan, sebagai hasilnya, munculnya metode baru memerangi penyakit manusia melalui pengobatan yang ditargetkan untuk disfungsi dari kedua komponen dari metaorganisme.

Valery Poroiko, Ph.D.
University of Chicago, Departemen Bedah Umum
Portal "Pemuda Abadi" www.vechnayamolodost.ru

Versi jurnal dari artikel yang diterbitkan di Popular Mechanics No. 4-2008

Identifikasi spesies bakteri dengan sekuensing gen 16S RNA ribosom, peran dan tempat metode dalam diagnosis infeksi bakteri. Selesai: Saveliev. - presentasi

Presentasi ini diterbitkan 4 tahun yang lalu oleh Ludmila Shumikhina

Presentasi terkait

Presentasi dari kelas 11 pada topik: "Identifikasi spesies bakteri dengan sekuensing gen 16S RNA ribosom, peran dan tempat metode dalam diagnosis infeksi bakteri. Selesai: Saveliev.". Unduh secara gratis dan tanpa registrasi. - Transkrip:

1 Identifikasi spesies bakteri dengan urutan gen 16S RNA ribosom, peran dan tempat metode dalam diagnosis infeksi bakteri : Cand. biol. Afonyushkin Vasily Nikolaevich PhD biol. Afonyushkin Vasiliy Nikolaevich

2 Tugas: 1. Menguasai metode elektroforesis DNA dalam gel agarosa 2. Untuk menguasai metode penganalisaan hasil sekuensing dan untuk membangun urutan nukleotida fragmen gen 16 S dari RNA ribosom dari isolat bakteri Bacillus yang diisolasi 1. Untuk menguasai metode elektroforesis DNA pada gel agarosa 2. Untuk menguasai metode menganalisis hasil sekuensing dan melaksanakan konstruksi urutan nukleotida dari fragmen gen 16 S dari RNA ribosom dari isolat yang diperoleh dari genus Bacillus 3. Memeriksa prospek untuk penggunaan bersama dari metode sekuensing dan biokimia identifikasi bakteri 3. Untuk mempelajari prospek untuk berbagi metode pengurutan dan identifikasi biokimia bakteri.Tujuan: Untuk mempelajari kemungkinan metode identifikasi spesifik bakteri menggunakan metode pengurutan gen 16S RNA ribosom dalam kombinasi dengan metode identifikasi tradisional.

3 bahan dan metode Biakan murni isolat ditaburkan pada MPA dan, setelah berjam-jam inkubasi, suspensi bakteri disiapkan pada buffer fosfat-salin. Kultur diwarnai Gram dan mikroskopis. Dievaluasi berikut sifat biokimia: Pembuangan sitrat, malonat, glukosa, laktosa, manitol, sukrosa, inositol, sorbitol, arabinosa, maltosa, fenilalanin, pembentukan indol, hidrogen sulfida, atsetilmetilkarabinola (Reaksi Foges- Proskauer), kehadiran beta-galaktosidase, urease, arginin dekarboksilase dan lisin, hidrolase arginin. Kultur diuji untuk katalase, aktivitas oksidase sitokrom, pembentukan nitrit, sintesis pigmen, resistensi antibiotik, mempelajari sifat budaya dan morfologi. Beta-galaktosidase, dan tritofandezaminaznuyu glyukoronidaznuyu aktivitas diuji pada media Uriselekt 4 (BioRad) DNA diisolasi oleh pandangan fenolhloroformennym ditentukan berdasarkan urutan 16S gen ribosom dari RNAi fragmen dari spacer intergenik dari RNA ribosom dan 16-23S pluralitas karakteristik biokimia, budaya dan morfologi.

4 Properti budaya: budaya yang tumbuh tidak tumbuh pada medium Endo, yaitu. tidak termasuk enterobacteria, tumbuh pada daging-peptone agar dan di bawah kondisi aerobik pada 37 ° C. Sifat taktorial: kultur tumbuh diperiksa secara mikroskopis dan diberi pewarnaan Gram, yang memungkinkan untuk menetapkan bahwa kultur yang diperoleh termasuk batang pembentuk spora. Karakteristik kultur

5 Desain studi: DNA diisolasi dari kultur tumbuh dan PCR dibentuk dengan primer universal, sebagai hasilnya, kami memperkuat fragmen gen 16S RNA ribosom

6 Larutan dengan primer didistribusikan dalam 4 tabung reaksi, masing-masing berisi 4 deoxynucleotides dATP, dTid, dTPP (salah satunya ditandai dengan isotop radioaktif) dan satu dari empat 2; itu diaktifkan di semua posisi campuran rantai tumbuh, dan setelah kemelekatannya, pertumbuhan rantai segera berhenti. Sebagai hasilnya, di masing-masing dari empat tabung, dengan partisipasi DNA polimerase, satu set unik oligonukleotida dengan panjang yang berbeda dibentuk, termasuk urutan primer. Selanjutnya, formalid ditambahkan ke tabung untuk divergensi rantai dan elektroforesis gel poliakrilat dilakukan pada empat jalur. Radioautografi dilakukan, yang memungkinkan Anda untuk "membaca" urutan nukleus dari segmen DNA yang akan diurutkan. Dalam biokimia dan biologi molekuler, elektroforesis digunakan untuk memisahkan makromolekul protein dan asam nukleat (serta fragmennya). Ada banyak variasi metode ini. Metode ini menemukan aplikasi terluas untuk pemisahan campuran biomolekul menjadi fraksi atau zat individu dan digunakan dalam biokimia, biologi molekuler, diagnostik klinis, biologi populasi (untuk mempelajari variabilitas genetik), dan asam nukleat protein lainnya. Elektroforesis adalah fenomena elektrokinetik pergerakan partikel fase terdispersi (koloid atau protein solusi) dalam media cair atau gas di bawah aksi medan listrik eksternal.Fenomena elektrokinetik dari medan listrik Elektroforesis Desain penelitian: Produk PCR dipisahkan oleh elektroforesis gel agarose. Metode Sanger

7 Hasil penelitian kami sendiri Fig.1 Hasil elektroforesis kapiler dari fragmen gen 16 S RNA ribosom

8 Gambar 2 pohon filogenetik dibangun atas dasar hasil penyelarasan fragmen gen 16S RNA ribosom

9 Hasil dari penelitian Pic sendiri. 3 Hasil perbandingan urutan nukleotida

10 Hasil budaya penelitian biokimia menggunakan uji PBDE sifat biokimia dari strain B.licheniformis: pemanfaatan negatif sitrat, malonat negatif, natrium sitrat + glukosa lisin negatif negatif, arginin negatif, ornithine negatif, fenilalanin negatif, indol negatif, urease atsetilmetilkarabinol positif negatif sulfida negatif, glukosa positif, b-galactosidase positif, laktosa negatif, isyarat positif, sukrosa positif, inositol positif oh, sorbitol positif, maltosa positif

11 Kesimpulan Identifikasi khusus mikroorganisme berdasarkan sekuensing mungkin adalah "standar emas" dari diagnosa laboratorium, namun, keakuratan metode ini dibatasi oleh akurasi dan kelengkapan database GenBank dan, oleh karena itu, memerlukan penggunaan tambahan tes konfirmasi.

Analisis rna 16s

Bioteknologi, 2005, №6, p 3-11

Metode untuk identifikasi mikroorganisme berdasarkan analisis panjang polimorfisme fragmen restriksi (PDFR) dari produk PCR gen 16S RNA dengan panjang 1500 nukleotida diusulkan. Satu set dari 6 endonuklease restriksi (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI, dan RsaI) dipilih, yang memungkinkan identifikasi berbagai mikroorganisme menggunakan PCGF.
Empat isolat fosfatase alkalin termolabil diisolasi dari isolat alami air laut. Analisis PDFR untuk strain ini dibandingkan dengan hasil yang dihitung untuk gen 16S RNA dari berbagai mikroorganisme, memungkinkan untuk menetapkan bahwa produsen diidentifikasi milik genus Alteromonas.

Seiring dengan metode tradisional mengidentifikasi mikroorganisme menggunakan karakteristik budaya dan morfologi, serta reaksi kimia dan biokimia [1], metode untuk menentukan mikroorganisme berdasarkan perbandingan urutan nukleotida dari berbagai gen mikroorganisme [2-4] dan analisis polimorfisme dari panjang fragmen restriksi DNA yang diperoleh sebagai hasil amplifikasi gen bakteri individual [5, 6]. Gen-gen yang mengkode RNA ribosomal 16S dan 23S adalah yang paling cocok untuk identifikasi, karena mereka hadir di semua sel bakteri dan genus-spesifik untuk sebagian besar mikroorganisme [7-9]. Penggunaan fragmen DNA yang mengandung gen 16S dan 23S RNA dan spacer di antara mereka, yang lebih bervariasi, dapat digunakan untuk mengidentifikasi spesies yang terkait erat dan subspesies mikroorganisme [10].

Makalah ini menyajikan hasil analisis RFLP dari produk PCR 1500 nukleotida panjang untuk mikroorganisme yang berbeda dan menunjukkan bahwa penggunaan pembatasan endonuklease 6 Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI RsaI dan andal dapat mengidentifikasi sebagian mikroorganisme. Dalam karya ini, 4 produsen baru alkali fosfatase termolabil diidentifikasi dan menggunakan metode yang diusulkan, analisis komparatif PDPR dilakukan untuk mengidentifikasi mikroorganisme ini. Berdasarkan perbandingan, disimpulkan bahwa produsen yang ditemukan termasuk genus Alteromonas.

KONDISI PERCOBAAN

Untuk mengidentifikasi produsen thermolabile alkaline phosphatase, 50 μl air laut digiling pada permukaan agar nutrisi dan dianalisis seperti yang dijelaskan dalam [11]. Produksi biomassa mikroorganisme dilakukan dengan menumbuhkan produsen pada 20 ° C dalam kaldu yang mengandung 1% tryptone (AGS GmbH, Jerman), ekstrak ragi 0,5% (perusahaan yang sama) dan air garam (NaCl - 27,5, MgCl2 - 5, MgSO4 - 2, CaCl2 - 0,5, KCl - 1, FeSO4 - 0,001 g / l [12]), pH 7,2-7,7. Kaldu yang diunggulkan didistribusikan dalam 200 ml dalam 700 ml botol goyang dan dikocok pada 150 rpm selama 16 jam.

Isolasi DNA kromosom dilakukan sesuai dengan metode [13].

Amplifikasi gen 16S RNA ribosom dilakukan menggunakan reaksi berantai polimerase seperti yang dijelaskan dalam [14].

Reaksi pembatasan dari DNA yang diperkuat dilakukan selama 4 jam pada 37 ° C dalam 20 μl campuran reaksi yang mengandung 2 unit. bertindak Batasi penggunaan Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI atau RsaI yang diproduksi oleh NPO SibEnzyme, di buffer yang sesuai. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 5 ml larutan berhenti yang mengandung 0,1 M EDTA, 0,05% bromofenol biru dan 40% sukrosa.

Pemisahan elektroforetik dari produk dari restriksi DNA yang diperkuat dilakukan dalam 2% agarose (Sigma) dalam buffer tris-asetat dengan ethidium bromide (0,5 mg / l) pada 120 V selama 4 jam.

Untuk menentukan panjang fragmen DNA, penanda berat molekul DNA digunakan (100bp +1,5 Kb penanda DNA, NPO SibEnzyme). Penentuan panjang batasan yang diperoleh dilakukan menggunakan program komputer Gel Pro Analyzer, versi 4.0.00.001. Identitas persen dari panjang fragmen dihitung untuk setiap pasangan mikroorganisme, membandingkan pola pembatasan secara terpisah untuk setiap enzim restriksi. Ketika membandingkan panjang restriksi, fragmen DNA dianggap identik, panjangnya berbeda tidak lebih dari 5%.

Untuk membandingkan data eksperimen dengan sekuens gen 16S RNA yang diterbitkan, bank data genetik dari rangkaian urutan digunakan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Dari isolat alami air laut, kami mengisolasi empat strain-produsen thermolabile phosphatase, yang ditetapkan sebagai 20, 27, 48 dan strain yang dijelaskan sebelumnya [11] menggunakan metode tradisional sebagai Alteromonas undina. Untuk mengidentifikasi strain yang diperoleh dari biomassa mikroorganisme yang ditanam dalam media nutrisi cair dengan penambahan garam laut, DNA kromosom diisolasi.
Selanjutnya, DNA kromosom digunakan dalam reaksi rantai polimerase untuk memperkuat gen 16S RNA ribosom. Produk amplifikasi secara independen diobati dengan 6 endonuklease restriksi yang berbeda. Semua pembatasan yang digunakan oleh kami memiliki situs pengenal tetranukleotida, yang memungkinkan untuk memperoleh dari 3 hingga 8 fragmen DNA sebagai akibat pembelahan produk amplifikasi, yang panjangnya sekitar 1500 nukleotida. Enzim restriksi Sse9I dan Tru9I yang digunakan memiliki, masing-masing, situs pengenalan AATT dan TTAA, sedangkan enzim restriksi BSuRI dan MspI memotong melalui situs GGCC dan CCGG. Situs pembatasan BstMBI dan RsaI, masing-masing GATC dan GTAC, mengandung semua empat nukleotida. Pemilihan endonuklease restriksi seperti itu, menurut pendapat kami, harus memberikan universalitas dalam identifikasi mikroorganisme dengan genom kaya AT dan GC yang kaya. Secara kuantitatif, penggunaan hanya enam pembatasan yang berbeda kami percaya optimal, karena penggunaan pembatasan endonuklease 1 atau 3, seperti yang disarankan dalam beberapa penelitian [10,15] tidak dapat mendeteksi polimorfisme untuk identifikasi organisme berkaitan erat atau sebaliknya, menyebabkan terlalu besar perbedaan iz untuk satu atau lebih mutasi acak. Pada saat yang sama, penggunaan 10 endonuklease restriksi yang berbeda tidak menyebabkan identifikasi tambahan dari polimorfisme panjang fragmen restriksi DNA dan jelas berlebihan [9].
Gambar 1 menunjukkan simulasi menggunakan pembatasan gambar komputer genov16S RNA, kami telah mengusulkan satu set enam enzim restriksi (Sse9I, Tru9I, BsuRI, MspI, BstMBI dan RsaI). Gen RNA 16S diambil dari bank genetik dari rangkaian urutan. Pilihan mikroorganisme cukup acak. Semua bakteri berasal dari genera yang berbeda dan mewakili mikroorganisme gram negatif dan gram positif. Terlihat bahwa untuk semua mikroorganisme memiliki pola unik dari serangkaian pembatasan. Jumlah fragmen DNA bervariasi dari 23 hingga 30 (fragmen panjang kurang dari 100 pasangan basa tidak diperhitungkan). Hasil perhitungan identitas persen dari panjang fragmen DNA (fragmen restriksi dianggap panjang identik berbeda dengan tidak lebih dari 5%) untuk pasangan yang berbeda dari mikroorganisme ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel ini menunjukkan hanya sebagian dari kemungkinan pasang mikroorganisme ditunjukkan pada Gambar. 1. Tetapi hasil perbandingan yang disajikan cukup khas dan memungkinkan kita untuk melihat bahwa identitas persen dari panjang fragmen DNA biasanya berkisar antara 12-28% untuk perwakilan dari genera mikroorganisme yang berbeda. Dengan demikian, data ini menunjukkan bahwa pola pembatasan gen 16S RNA dengan set enzim restriksi yang ditawarkan oleh kami dapat berfungsi sebagai dasar untuk mengidentifikasi genus sel bakteri.

Fig. 1. Pola Secara teoritis dihitung pemisahan elektroforesis 16S RNA produk amplifikasi gen setelah pengobatan dengan enzim restriksi Sse9I (1), Tru9I (2), BsuRI (3), MspI (4), BstMBI (5) dan RsaI (6). Lintasan M - penanda berat molekul

Nilai 16S RNA dalam sistematika. Hibridisasi molekuler dari 16S RNA.

Hibridisasi molekuler dari 16S rRNA. Prokariotik ribosom terdiri dari 3 subunit, besar (23S), (5S) dan (16S). Gen 16S rRNA memiliki sifat-sifat berikut yang penting dalam filogeni:

1. RNA ribosom bersifat universal untuk spesies yang berbeda, seperti ribosom itu sendiri. 2. Molekul 16S rRNA adalah konservatif dan paling tidak rentan terhadap perubahan dalam perjalanan evolusi biologis. Tingkat perubahan gen 16S rRNA dalam berbagai bakteri simbiosis adalah 2-4% dari substitusi nukleotida di atas 60 Myr.3. Gen 16S rRNA memiliki wilayah dan domain variabel (domain) yang ultrasonserved, yang memungkinkan untuk mengevaluasi hubungan kekerabatan yang jauh dan dekat. Selain itu, ditemukan bahwa rRNA cistron tidak terlibat dalam proses transfer genetik interspesifik. Ukuran gen (dalam prokariota, sekitar 1550-1640 bp panjangnya) optimal dari sudut pandang mengurangi kesalahan statistik. Urutan lengkap dapat ditentukan dalam satu urutan menggunakan metode Sanger. Perbandingan direktori nukleotida. Metode ini digunakan pada awal 80-an dan sangat penting dalam sejarah sistematika bakteri. Pada saat yang sama, molekul RNA (16S rRNA) diperlakukan dengan ribonuklease T, yang memotong molekul menjadi residu guanin. Ukuran fragmen yang diperoleh tidak lebih dari 20 nukleotida. Oligonukleotida yang dihasilkan dipisahkan oleh elektroforesis 2 dimensi, diurutkan, dan menyusun katalog yang secara khusus mencirikan molekul rRNA. Ketika membandingkan katalog, fragmen setidaknya 6 nukleotida panjangnya diperhitungkan. Dengan menerapkan koefisien kemiripan antara katalog, pohon filogenetik umum untuk prokariota pertama kali dibangun. Riboprinting. Metode ini didasarkan pada analisis pembatasan gen rRNA. Untuk ini, DNA total diisolasi dari sel. Dua primer homolog ke daerah mengapung yang sangat lestari dari gen 16S rRNA (small subunit - ss rDNA) diambil dan PCR dilakukan. Fragmen diproses dengan beberapa endonuklease restriksi, dan produk pembatasan untuk masing-masing endonuklease dipisahkan pada gel agarosa bersama dengan profil DNA standar ukuran. Polimorfisme panjang fragmen terjadi karena fakta bahwa bagian dari situs pembatasan jatuh ke dalam domain konservatif dari gen, dan beberapa - ke dalam domain variabel. Di bagian fragmen ini akan umum untuk semua spesies dalam sampel. Dengan jumlah fragmen umum dan berbeda, adalah mungkin untuk menghitung jarak genetik antar spesies. Penggunaan 12 enzim restriksi dengan lokasi pengakuan dari 4 nukleotida panjangnya memungkinkan untuk menutupi 10-15% dari panjang gen 16S rRNA dengan analisis tanpa sekuensing.

Microbe yang terhormat

Valery Poroiko,
Ph.D., Universitas Chicago, Departemen Bedah Umum
Mekanika Populer ı4, 2008

Seratus tahun yang lalu, mikroba yang hidup di usus manusia dianggap sebagai parasit dan hama. Dalam beberapa tahun terakhir, mikrobiota manusia telah disebut sejenis organ tubuh kita, yang diperlukan untuk fungsi normal tubuh.

Sejak waktu Pasteur, telah diketahui bahwa saluran pencernaan manusia pada dasarnya adalah bioreaktor tipe aliran, di mana banyak mikroorganisme menghuni. Sikap para ilmuwan terhadap mikroflora usus selama ini telah berubah secara radikal. Seratus tahun yang lalu, Ilya Mechnikov yang hebat, pendiri teori modern imunitas, untuk penciptaan yang ia terima Hadiah Nobel (untuk dua dengan lawan bebuyutannya, Paul Ehrlich yang tidak kalah hebat), bahkan menawarkan untuk menghapus usus besar sebagai salah satu cara untuk memperpanjang hidup. Dan bagi mereka yang ukuran ini tampak terlalu radikal, saya merekomendasikan untuk minum sebanyak mungkin kefir untuk menekan berbahaya, menurut pendapatnya, mikroba dengan bakteri asam laktat yang bermanfaat. Setelah setengah abad, kursus telah berubah 180 derajat. Ternyata mikroflora usus normal, serta kulit dan selaput lendir, melakukan banyak fungsi yang berguna - misalnya, itu menekan aktivitas vital mikroorganisme patogen yang terus-menerus menyerang tubuh. Dan dalam beberapa tahun terakhir, para ahli mikrobiologi yang paling berani telah melangkah lebih jauh, menyatakan manusia dan mikroba-nya sebagai superorganisme simbiotik tunggal.

Pengembangan metode biologi molekuler membawa para ilmuwan ke tingkat pemahaman baru tentang proses simbiosis manusia dan mikroflora, yang tampaknya dipelajari dengan baik dan tidak mengharapkan kejutan khusus dari studi lebih lanjut. Pertumbuhan cepat dalam kecepatan dan jatuhnya biaya metode pengurutan DNA (menentukan urutan nukleotida) dan peningkatan paralel dalam kekuatan komputer pribadi dan perkembangan Internet memungkinkan untuk menganalisis informasi pada daerah genom besar. Setelah kromosom dari ratusan spesies bakteri individu telah diuraikan, pendekatan baru telah muncul dalam genetika mikroorganisme - berdasarkan populasi: menganalisis gen semua bakteri dari area tertentu sekaligus. Tentu saja, populasi "bioreaktor manusia" ternyata menjadi salah satu yang paling penting untuk studi populasi mikroba.

Pekerjaan pertama, yang mengarah pada tampilan baru pada mikrobiota usus, diterbitkan pada tahun 1999 oleh sekelompok ilmuwan dari Institut Nasional Penelitian Agronomi (Prancis) dan Universitas Reading (Inggris). Para penulis memutuskan untuk menerapkan metode pengurutan gen 16S RNA untuk mempelajari populasi mikroba usus (lihat sidebar).

16S PHK - ID Bakteri

Langkah pertama dalam penentuan mikroorganisme adalah budidaya mereka pada media nutrisi. Tetapi sejumlah mikroba tidak mau tumbuh di media apa saja.

Teknik modern
Studi bakteri yang sebelumnya tidak dapat diakses non-culturable dan mulai memaksakan ketertiban di benar-benar membingungkan taksonomi prokariotik sudah dikenal menjadi mungkin dengan perkembangan bioinformatika dan munculnya teknik-teknik modern biologi molekuler - PCR memungkinkan satu daerah DNA untuk menerima miliaran replika, kloning gen yang dipilih dalam plasmid bakteri dan sequencing sekuens metodologi nukleotida yang diperoleh dalam jumlah yang cukup untuk analisis. Sebuah penanda ideal untuk mengidentifikasi mikroorganisme adalah gen yang mengkode RNA ribosom 16S (masing-masing dari dua subunit dari lokakarya sel ribosom untuk sintesis protein - terdiri dari molekul protein yang terjalin dan rantai asam ribonukleat).

Spidol sempurna
Gen ini ada dalam genom semua bakteri dan archaea yang diketahui, tetapi tidak ada pada eukariot dan virus, dan jika Anda telah menemukan urutan nukleotida karakteristiknya, Anda pasti berurusan dengan gen prokariot. Gen ini memiliki kedua wilayah konservatif, sama untuk semua prokariota, dan spesifik-spesies. Situs konservatif berfungsi untuk tahap pertama dari reaksi rantai polimerase - melampirkan tes DNA ke primer (situs benih DNA yang dipelajari oleh rantai nukleotida yang diteliti untuk mulai menganalisis sisa rangkaian), dan spesifik-spesies - untuk menentukan spesies. Tingkat kesamaan plot spesifik spesies mencerminkan kekerabatan evolusi spesies yang berbeda. Untuk kloning dan analisis selanjutnya, Anda dapat menggunakan RNA ribosom itu sendiri, yang ada di sel mana pun dalam jumlah yang lebih besar daripada gen yang sesuai. Urutan nukleotida 16S RNA dari semua bakteri dan arkaea yang dikenal tersedia secara luas. Urutan diidentifikasi dibandingkan dengan mereka dalam database dan mengidentifikasi jenis bakteri atau menyatakan itu milik spesies yang tidak diolah.

Taksonomi baru
Baru-baru ini telah ada revisi intensif dari klasifikasi bakteri fenotipe lama berdasarkan kriteria yang diformalkan dengan buruk - dari penampilan koloni ke preferensi makanan dan kemampuan untuk diwarnai dengan berbagai zat warna. Sistematika baru didasarkan pada kriteria molekuler (16S RNA) dan hanya sebagian mengulangi fenotipik.

Apa yang kita miliki di dalam

Urutan pengkodean 16S RNA diekstraksi langsung dari "lingkungan" oleh 125 mg manusia dengan cara reaksi rantai polimerase (PCR), maaf, bangku dimasukkan ke dalam plasmid Escherichia coli (bukan karena usus, tetapi karena Escherichia coli adalah salah satu favorit workhorses dari ahli biologi molekuler) dan sekali lagi diisolasi dari budaya bakteri yang diperbanyak. Dengan demikian, perpustakaan gen RNA 16S dari semua mikroorganisme dalam sampel dibuat. Setelah itu, 284 klon dipilih secara acak dan diurutkan. Ternyata hanya 24% dari sekuens 16S RNA yang diperoleh milik mikroorganisme yang diketahui sebelumnya. Selama lebih dari seratus tahun, tiga perempat dari mikroflora di usus setiap orang telah menghindari perhatian para peneliti yang dipersenjatai dengan metode-metode mikrobiologi klasik! Para ilmuwan hanya tidak dapat menemukan kondisi untuk budidaya bakteri ini, karena penduduk yang paling berubah-ubah dari usus menolak untuk tumbuh pada media mikrobiologi tradisional.

Hari ini, menggunakan metode molekuler, telah ditetapkan bahwa 10 dari 70 taksa bakteri besar terwakili dalam mikrobiota orang dewasa. Sekitar 90% dari mikroba kami milik jenis Firmicutes (termasuk, misalnya, lactobacilli yang terkenal - utama "penyebab" susu souring) dan Bacteroidetes - wajib anaerob (organisme yang bisa hidup hanya dalam ketiadaan oksigen), yang sering digunakan sebagai indikator polusi pembuangan air alami. Sisanya 10% dari populasi dibagi antara taksa Proteobacteria (ini termasuk, antara lain, E. coli), Actinobacteria (dari salah satu spesies Actinomycetes antibiotik streptomisin diisolasi), Fusobacteria (penduduk normal rongga mulut dan sering menyebabkan periodontitis), Verrucomicrobia (baru-baru ini di sumber panas bumi ditemukan memiliki bentuk mikroba yang memakan metana, yang melimpah di usus karena aktivitas vital mikroorganisme lainnya, Cyanobacteria (mereka masih sering disebut "ganggang biru-hijau" sampai sekarang), Spirochaetes (untungnya) nd, tidak pucat), Synergistes dan VadinBE97 (jenis hewan, meminta pencipta taksonomi baru prokariota).

Mikroba dalam diri kita lebih dari manusia

Untuk tujuan ini, teknologi sekuensing DNA yang paling otomatis, terkomputerisasi dan berkinerja tinggi digunakan, yang memungkinkan untuk menganalisis urutan nukleotida pendek, menyusun teka-teki pada beberapa huruf yang cocok di ujung bagian ini, berulang kali mengulangi prosedur ini untuk setiap bagian genom dan mendapatkan dekode gen dan kromosom individual. dengan kecepatan hingga 14 juta nukleotida per jam - lipat lebih cepat daripada yang mereka lakukan beberapa tahun yang lalu. Jadi, ditemukan bahwa mikrobiota usus memiliki sekitar 100 triliun sel bakteri - sekitar sepuluh kali lebih banyak daripada jumlah sel dalam tubuh manusia.

Seperangkat gen yang membentuk metagenome bakteri sekitar seratus kali lebih besar daripada kumpulan gen tubuh manusia. Jika kita berbicara tentang volume reaksi biokimia yang terjadi di dalam populasi mikroba, itu lagi berkali-kali lebih tinggi daripada volume reaksi biokimia dalam tubuh manusia.

Bakteri "reaktor" alat dalam rantai tuan rumah metabolisme yang yang tidak mampu mendukung dirinya sendiri - misalnya, sintesis vitamin dan prekursor mereka, dekomposisi beberapa racun, dekomposisi selulosa untuk polisakarida dicerna (di ruminansia), dll...

Dari bayi hingga usia lanjut

Terlepas dari kenyataan bahwa komposisi spesies mikroorganisme usus agak monoton, rasio kuantitatif perwakilan kelompok sistematik tertentu dalam mikrobiota orang yang berbeda dapat sangat bervariasi. Tapi apa itu mikroflora usus normal dan bagaimana cara pembentukannya?

Pertanyaan ini dijawab dalam sebuah karya 2007 oleh sekelompok ahli biologi Amerika yang dipimpin oleh Patrick Brown dari Universitas Stanford. Mereka menelusuri pembentukan mikrobiota pada 14 bayi yang baru lahir selama tahun pertama kehidupan. Para penulis mampu menetapkan beberapa sumber kolonisasi saluran pencernaan. Mikrobiota bayi memiliki kemiripan dengan mikroflora ibu: sampel vagina, feses atau mikroflora ASI. Tergantung pada sumber kolonisasi, spesies yang berbeda berlaku di mikroflora usus bayi selama tahun pertama kehidupan. Perbedaan ini tetap signifikan selama seluruh periode penelitian, tetapi pada usia satu tahun, pembentukan mikrobiota dewasa menjadi nyata. Data menarik diperoleh pada contoh sepasang kembar. Mikroflora di dalamnya hampir identik dalam komposisi dan berubah dengan cara yang sama juga. Temuan ini mengungkapkan peran besar dari komponen manusia dari pasangan mikrobiota-host dalam pembentukan populasi mikroflora usus. Demi kemurnian eksperimen, tentu saja, perlu untuk memisahkan bayi-bayi saat masih di rumah sakit (by the way, cerita yang luar biasa untuk film India! Selama bertahun-tahun, si kembar saling mengenal satu sama lain dari analisis mikroflora.). Tetapi data dari penelitian lain menegaskan asumsi bahwa individu, termasuk keturunan, fitur biokimia manusia memiliki pengaruh besar pada komposisi mikrobiota.

Tipis dan tebal

Studi yang dilakukan di laboratorium Jeffrey Gordon (School of Medicine di University of Washington, St. Louis, Missouri), memungkinkan untuk mengasosiasikan keragaman spesies bakteri dari saluran pencernaan dengan diet dan fitur metabolik individu. Hasil percobaan itu diterbitkan dalam majalah Nature edisi Desember 2006. Percobaan satu tahun menyarankan membangun korelasi antara kelebihan berat badan pada manusia dan komposisi populasi mikroba ususnya. Selusin orang gemuk yang setuju untuk meletakkan perut mereka di atas altar ilmu pengetahuan, dibagi menjadi dua kelompok. Satu melanjutkan diet rendah lemak, yang lain diet rendah karbohidrat. Semua relawan kehilangan berat badan, dan pada saat yang sama mereka mengubah rasio dari dua kelompok utama mikroorganisme usus: jumlah sel Firmicutes menurun, dan jumlah Bacteroidetes, sebaliknya, tumbuh. Pada diet rendah lemak, perubahan seperti itu menjadi terlihat kemudian - setelah pasien kehilangan 6% dari berat badan mereka, dan pada diet rendah karbohidrat - setelah kehilangan kilogram pertama (2% dari berat badan awal mereka). Dalam hal ini, perubahan komposisi mikroflora menjadi semakin nyata, semakin sedikit bobot peserta dalam eksperimen.

Memerangi obesitas

Hasil penelitian lebih lanjut oleh para ilmuwan tentang perubahan pada organisme tikus-mikroba simbiotik (lihat kotak "Diuji pada tikus") secara brilian menegaskan hipotesis bahwa mikrobiota individu obesitas berkontribusi terhadap pengolahan makanan yang lebih dalam. Perbandingan sampel DNA tinja dari tikus obesitas dan tikus normal menunjukkan bahwa mikrobioma obesitas jenuh dengan gen enzim yang memungkinkan degradasi polisakarida yang lebih efisien. Usus tikus gemuk mengandung sejumlah besar produk akhir fermentasi - senyawa asam asetat dan butirat, yang mengindikasikan pemrosesan komponen makanan yang lebih dalam. Kalorimetrik (dari kata “kalori”!) Analisis sampel tinja tikus menegaskan hal ini: tinja tikus ob / ob mengandung lebih sedikit kalori daripada tikus jenis liar yang tidak sepenuhnya menyerap energi dari makanan.

Selain informasi penting tentang "mikroba" komponen obesitas, penulis mampu menunjukkan kesamaan mendasar mikroflora pada orang gemuk dan tikus, yang membuka perspektif baru dalam studi masalah kelebihan berat badan, dan mungkin resolusi masalah ini dengan "transplantasi" mikroflora sehat atau pembentukannya pada pasien. kegemukan.

Diuji pada tikus

Dan dengan kelelahan

Fakta bahwa mikrobiota dapat mengontrol metabolisme tuan rumah tidak lagi diragukan. Penelitian laboratorium Gordon, yang ditujukan untuk masalah kelebihan berat badan, memungkinkan untuk melempar jembatan ke pengobatan penyakit metabolik. Di antara mereka adalah jenis-jenis kelelahan umum, yang mempengaruhi anak-anak dari satu sampai empat tahun di negara-negara miskin dengan iklim tropis, seperti marasmus (kata ini hanya memiliki hubungan linguistik dengan marasmus: Marasmoz Yunani secara harfiah berarti kelelahan, kepunahan) dan kwashiorkor (dalam bahasa salah satu suku Ghana kwashiorkor - "bocah merah"). Munculnya penyakit dikaitkan dengan kurangnya protein dan vitamin selama masa transisi dari menyusui hingga makanan dewasa. Tetapi penyakit secara selektif mempengaruhi anak-anak yang saudara-saudaranya tidak mengalami masalah dengan transisi ke pola makan tradisional untuk wilayah tersebut. Penelitian telah menunjukkan bahwa mikroflora usus pada anak-anak yang sakit sangat berbeda dari mikroflora orang tua mereka, serta dari mikroflora saudara dan saudari yang sehat. Pertama-tama, ada catatan ketidakhadiran hampir lengkap pada populasi usus Bacteroidetes dan dominasi spesies langka yang termasuk jenis-jenis Proteobacteria dan Fusobacteria. Setelah anak-anak yang sakit (hati-hati, agar tidak overdosis!) Diberi makan makanan protein-intensif, mikrobiota mereka tampak seperti yang normal, seperti pada kerabat, dengan prevalensi Bactrotetes dan Firmicutes.

Studi terbaru tidak hanya secara mendasar mengubah pemahaman saat ini dari mikroflora usus manusia, tetapi juga berkontribusi pada munculnya konsep yang menganggap mikrobiota usus sebagai "organ" manusia multiseluler tambahan. Organ yang terdiri dari berbagai jalur sel yang mampu berkomunikasi baik di antara mereka sendiri maupun dengan organisme inang. Tubuh yang mendistribusikan aliran energi, melakukan reaksi fisiologis yang penting, perubahan di bawah pengaruh lingkungan dan meregenerasi diri ketika perubahan disebabkan oleh kondisi eksternal. Melanjutkan studi tentang "organ bakteri" dapat dan harus mengarah pada pemahaman tentang hukum fungsinya, pengungkapan koneksi halus dengan organisme inang dan, sebagai hasilnya, munculnya metode baru memerangi penyakit manusia melalui pengobatan yang ditargetkan untuk disfungsi dari kedua komponen dari metaorganisme.

Analisis rna 16s

Ribosomal ribonucleic acids (rRNA) adalah beberapa molekul RNA yang membentuk dasar ribosom. Fungsi utama rRNA adalah untuk melaksanakan proses penerjemahan - membaca informasi dari mRNA menggunakan molekul tRNA adapter dan mengkatalisis pembentukan ikatan peptida antara asam amino yang melekat pada tRNA.

Konten

Ribosom Subpartikel dan rRNA Nomenclature

Pada gambar mikroskop elektron dari ribosom utuh, terlihat bahwa mereka terdiri dari dua subpartikel dengan ukuran yang berbeda.

Rasio massa dari subpartik adalah

2: 1; massa, pada gilirannya, dinyatakan dalam konstanta sedimentasi yang diukur secara langsung (tingkat sedimentasi dalam unit Svedberg, S) selama ultrasentrifugasi, parameter inilah yang membentuk basis dari nomenklatur rRNA dan, ribosom dan subpartikel ribosom: sebutan tipe yang digunakan

Sebagai contoh, RNA ribosom dari prokariota dengan koefisien sedimentasi dari 16 unit Svedberg ditetapkan sebagai 16S rRNA.

Karena koefisien sedimentasi tidak hanya bergantung pada berat molekul, tetapi juga pada bentuk partikel, koefisien sedimentasi selama disosiasi adalah non-aditif: misalnya, ribosom bakteri dengan massa molekul

3 * 10 6 Dalton memiliki koefisien sedimentasi 70S, ditetapkan sebagai 70S dan berdisosiasi menjadi subunit 50S dan 30S:

Ribosom subunit masing-masing mengandung satu molekul rRNA panjang panjang, yang massanya

1/2 - 2/3 dari massa subpartikel ribosom, sehingga, dalam kasus ribosom bakteri 70S, subunit 50S mengandung 23S rRNA (panjang

3000 nukleotida) dan subunit 30S mengandung 16S rRNA (panjang

1500 nukleotida); Selain rRNA “panjang”, subunit ribosom besar juga mengandung satu atau dua rRNA “pendek” (5S rRNA dari ribosomal subunit bakteri 50S atau 5S dan 5,8S rRNA dari subunit ribosomal eukariota yang lebih besar).

Sintesis

Ribosomal RNA membuat sebagian besar (hingga 80%) dari total RNA seluler, seperti jumlah rRNA membutuhkan transkripsi intens gen pengode. Intensitas ini disediakan oleh sejumlah besar salinan pengkodean rRNA: pada eukariota, ada beberapa ratus (

200 dalam ragi) hingga puluhan ribu (untuk berbagai jenis kapas, 50-120 ribu eksemplar dilaporkan) dari gen yang diatur dalam susunan pengulangan tandem.

Pada manusia, gen yang mengkode rRNA juga diorganisasikan ke dalam kelompok pengulangan tandem yang terletak di daerah pusat lengan pendek kromosom 13, 14, 15, 21, dan 22.

Mereka disintesis oleh RNA polimerase I sebagai molekul panjang RNA pre-ribosom, yang dipotong menjadi RNA terpisah yang membentuk dasar ribosom. Pada bakteri dan archaea, transkrip awal biasanya mencakup 16S, 23S dan 5S rRNA, di mana sekuens pra-rRNA dihapus. Biasanya antara gen 16S dan 23S rRNA terletak satu atau lebih gen tRNA; jadi, dalam E. coli, transkrip awal dari kelompok gen seperti itu memiliki urutan berikut:

(16S rRNA) - (1-2 tRNA) - (23S rRNA) - (5S rRNA) - (0-2 tRNA)

Transkrip seperti ini dipecah menjadi fragmen pra-rRNA dan tRNA oleh enzim ribonuklease III.

Pada eukariota, 18S, 5,8S dan 25/28 rRNA ditranskripsikan bersama dengan RNA polimerase I, sementara gen rRNA 5S ditranskripsikan dengan RNA polimerase III.

Pada eukariota, situs-situs konsentrasi gen yang mengkode rRNA biasanya terlihat dengan baik di inti sel, karena akumulasi subunit ribosom di sekelilingnya, yang segera dirakit. Gugus ini bernoda dengan pewarna sitologis dan dikenal sebagai nukleolus. Dengan demikian, keberadaan nukleolus adalah karakteristik tidak untuk semua fase siklus sel: selama pembelahan sel di profase, nucleolus berdisosiasi, karena sintesis rRNA ditangguhkan dan dibentuk kembali pada akhir telofase ketika sintesis rRNA dilanjutkan.

Analisis komparatif rRNA pro dan eukariotik

Ribosomal RNA (seperti ribosom) dari prokariota dan eukariota berbeda satu sama lain, meskipun mereka menunjukkan kesamaan yang signifikan antara daerah-daerah dari urutan. Ribosome prokariotik 70S terdiri dari subunit 50S besar (dibangun atas dasar dua molekul rRNA - 5S dan 23S) dan subunit 30S kecil (dibangun atas dasar 16S rRNA). Ribosome eukariotik 80S terdiri dari subunit 60S besar (dibangun atas dasar tiga molekul rRNA - 5S, 5.8S dan 28S) dan subunit 40S kecil (dibangun atas dasar 18S rRNA).

Menggunakan informasi urutan

Informasi tentang rRNA organisme tertentu digunakan dalam kedokteran dan biologi evolusioner.

  • Gen rRNA adalah salah satu gen yang paling konservatif (paling tidak variabel). Oleh karena itu, posisi sistematis organisme dan waktu divergensi dengan spesies dekat dapat ditentukan berdasarkan analisis persamaan dan perbedaan dalam urutan rRNA.
  • rRNA adalah target untuk sejumlah besar antibiotik, beberapa di antaranya digunakan dalam praktek klinis, baik untuk menekan pertumbuhan bakteri (antibiotik yang mengikat ribosom prokariotik) dan untuk mengobati penyakit manusia (antibiotik yang mengikat ribosom eukariotik). Kelompok pertama termasuk kloramfenikol, eritromisin, kasugamycin, microcoxin, spectinomycin, streptomisin, thiostrepton. Ke higromisin B kedua, paromomisin.

Artikel Sebelumnya

Mayevskaya Marina Viktorovna

Artikel Berikutnya

Antibodi Virus Hepatitis C

Artikel Terkait Hepatitis